RNAi干擾檢測核心要點概要

 　　RNAi干擾檢測是一個十分重要的環(huán)節(jié)。不管是設(shè)備還是環(huán)境都是要的合格，在進行干擾檢測之前應(yīng)該考慮靶基因產(chǎn)物的半衰期及其在細胞中的豐度和表達調(diào)控機制。由于RNAi干擾檢測是通過降解靶基因RNA而達到一直基因表達的目的，因此它不使用于研究那些具有長半衰期的蛋白質(zhì)在細胞中的功能，RNAi干擾檢測不能像基因敲除（gene knockout）一樣在特定的細胞中確實靶基因，它只能較大限度的抑制靶基因的表達，其抑制效率zui高可達95％以上，因此這種方法又被稱為基因敲減（gene knockdown）。據(jù)此，RNAi干擾檢測不適用于有些酶基因功能的研究，因為有時候微量的酶分子就可以在細胞中行使功能，酶基因表達的抑制并不能從表型上檢測到明顯的變化。
 
　　為了使RNAi干擾檢測達到理想效果，我們必須注意以下事項：
 
　　不同細胞的轉(zhuǎn)染效率不同，一次對于不同的轉(zhuǎn)染試劑和培養(yǎng)細胞需要通過預(yù)試驗來確定轉(zhuǎn)染的條件，對一種細胞行之有效的方法并不一定適用于另一種細胞。正常情況下生長狀況良好的細胞轉(zhuǎn)染效率比生長狀況較差的細胞要高。RNAi干擾檢測盡量采用傳代次數(shù)較少的細胞，因為轉(zhuǎn)染效率隨著傳代次數(shù)的增加而逐漸下降，一般采用傳代次數(shù)在50代以內(nèi)的細胞進行轉(zhuǎn)染。對細胞的轉(zhuǎn)染效率影響比較大的另一種因素是細胞的生長密度，RNAi干擾檢測對貼壁的細胞來說，*轉(zhuǎn)染密度為30％～70％，太低或太高都會導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率的下降。
 
　　如果一個siRNA分子在細胞中不能抑制靶基因的表達，首先應(yīng)該查明RNAi干擾檢測所采用的基因序列和試驗用的細胞系是否來源于同一物種，然后檢查所采用的基因序列是否是可靠的，因為它可能存在序列錯誤、突變（在腫瘤細胞中）或核苷酸多態(tài)性。
 
　　RNAi干擾檢測抑制靶基因的表達以后，先觀察細胞表型的變化，如細胞生長狀況與形狀的變化。然后通過免疫印記與免疫熒光檢測細胞內(nèi)蛋白質(zhì)水平的變化。如果沒有特異性的靶蛋白抗體，RNAi干擾檢測可以通過Northern印記確定其mRNA變化。
 
　　必須采取措施防止并消除可能的Rnase污染。因為極少量的Rnase就可以破壞整個RNAi干擾檢測試驗，而RNAase遍布整個實驗室，用適當(dāng)?shù)年栃詓iRNA對照優(yōu)化轉(zhuǎn)染和檢測條件。對于大多數(shù)細胞來說看家基因是zui合適的陽性對照，用不同濃度的看家基因siRNA轉(zhuǎn)染細胞，RNAi干擾檢測48小時后檢測看家基因蛋白質(zhì)或mRNA水平，以確定靶siRNA轉(zhuǎn)染的*條件，試驗中應(yīng)包含1～2個陰性對照以確定siRNA分子對靶基因的抑制作用的特異性。
 
　　RNAi干擾檢測用于轉(zhuǎn)染的siRNA分子的濃度同靶基因的特性和細胞類型相關(guān)。濃度太高會導(dǎo)致細胞毒性，濃度太低則不易檢測到靶基因表達水平的變化一次用于轉(zhuǎn)染細胞的siRNA分子濃度一般在30～100nmol/L之間，體外合成的siRNA分子對靶基因的抑制作用是瞬時的，RNAi干擾檢測細胞中受到抑制的靶蛋白一般在轉(zhuǎn)染5～7天之后，即經(jīng)過7～10個細胞增殖周期之后就可以逐漸恢復(fù)至正常水平。
 
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