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miRNA定量檢測(cè)的*

  • 發(fā)布日期:2014-11-24      瀏覽次數(shù):2276
    •    所謂miRNA定量檢測(cè)就是對(duì)已經(jīng)獲得的目的DNA片段進(jìn)行重新克隆,其目的在于對(duì)目的DNA進(jìn)行進(jìn)一步分析,或者進(jìn)行重組改造等。miRNA定量檢測(cè)的基本過(guò)程包括:(1)目的DNA片段和載體的制備;(2)目的DNA片段和載體的連接;(3)連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化;(4)重組子篩選。
        選擇適宜的限制性核酸內(nèi)切酶,消化已知目的DNA和載體,獲得線性DNA,用于重組。根據(jù)目的DNA和載體的具體情況,選擇一種或者兩種適當(dāng)?shù)南拗泼盖懈睿謩e產(chǎn)生對(duì)稱性粘性末端(用一種限制性內(nèi)切酶進(jìn)行消化而產(chǎn)生帶有互補(bǔ)突出端)、不對(duì)稱粘性末端(用兩種不同的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行消化而產(chǎn)生帶有非互補(bǔ)突出端)、平端。在miRNA定量檢測(cè)時(shí),不對(duì)稱相容末端連接,次選對(duì)稱性粘性相容性末端連接,由于平末端連接效率較低,通常很少采用。但有時(shí)目的片段的末端與載體不匹配 ,一般先將不匹配末端補(bǔ)平,然后再以平末端連接。
        miRNA定量檢測(cè)實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)
        (一)定量檢測(cè)實(shí)驗(yàn)對(duì)照設(shè)置
        為使miRNA定量檢測(cè)實(shí)驗(yàn)成功,并能在未獲得目的克隆時(shí),查明實(shí)驗(yàn)失敗的原因,每次實(shí)驗(yàn)應(yīng)包括相應(yīng)的對(duì)照。其中包括感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率、抗菌素是否有效、連接的效率、未連接質(zhì)粒的背景、磷酸酶處理的效果等。
        (二)miRNA定量檢測(cè)檢測(cè)連接反應(yīng)的效果的對(duì)照實(shí)驗(yàn)
        為檢測(cè)連接反應(yīng)的效果,線化(單限制性酶切,非磷酸酶處理)質(zhì)粒需同實(shí)驗(yàn)樣品平行連接。取一部份連接反應(yīng)液用于轉(zhuǎn)化,隨后涂布到選擇培養(yǎng)基上。平板上所生長(zhǎng)的菌落數(shù),可同相同量、未連接的線化質(zhì)粒、轉(zhuǎn)化相同數(shù)目的細(xì)菌后,涂布在選擇培養(yǎng)基上所生長(zhǎng)的菌落數(shù)比較。如果連接成功,自連接質(zhì)粒在平板上的菌落數(shù),miRNA定量檢測(cè)會(huì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于未連接的線化質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)菌所得的菌落數(shù)。如果線化成功,未連接的線化質(zhì)粒(未連接的質(zhì)粒背景)所得的菌落數(shù)應(yīng)很低。如miRNA定量檢測(cè)連接效率高,則自連質(zhì)粒所得的菌落數(shù)應(yīng)同用完整質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)菌所得的菌落數(shù)相近。 另一種非定量的方法是將等量的未連接質(zhì)粒和連接質(zhì)粒在瓊脂上電泳,連接后的樣品的遷移率會(huì)降低。
        (三)miRNA定量檢測(cè)連接實(shí)驗(yàn)需要優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)指標(biāo)
        1、載體和插入片段的摩爾濃度比特別重要,載體:插入片段的摩爾數(shù)的變化范圍可為8:1到1:16,但通常的變化范圍是3:1到1:3。插入片段的長(zhǎng)度和序列的變化會(huì)影響和同一載體的連接效果。每一個(gè)連接反應(yīng)都需要作實(shí)驗(yàn),來(lái)選擇*的載體和插入片段的摩爾數(shù)比。在zui小的反應(yīng)體積中,通常一個(gè)連接反應(yīng)用10~50 ng的載體DNA。
        2、進(jìn)行連接反應(yīng)時(shí)的保溫的時(shí)間和溫度也需優(yōu)化。一般而言,平末端連接在22℃保溫4~16小時(shí),粘性末端在22℃保溫3小時(shí),或4℃保溫16小時(shí)。大多數(shù)連接反應(yīng)用miRNA定量檢測(cè)連接酶,但大腸桿菌的DNA連接酶可用于粘性末端的連接,平末端連接時(shí)用此酶,活力較低。每次連接反應(yīng)用1~10 Weiss單位的高質(zhì)量連接酶。
        3、用于轉(zhuǎn)化連接反應(yīng)液的細(xì)菌菌株,以及用于重組質(zhì)粒擴(kuò)增的菌株,需經(jīng)挑選,細(xì)菌生長(zhǎng)的溫度也要挑選。當(dāng)用pGEM載體克隆大片段時(shí)(>7~8 kb),經(jīng)轉(zhuǎn)化的菌株在30℃而不是在37℃生長(zhǎng),更有利于連接。作簡(jiǎn)單的miRNA定量檢測(cè)連接實(shí)驗(yàn),定量檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率的感受態(tài)細(xì)胞就可滿足克隆需要,更高轉(zhuǎn)化效率的感受態(tài)細(xì)胞可用于作比較困難的克隆實(shí)驗(yàn)。為提高獲得目的克隆的機(jī)會(huì),應(yīng)用盡可能高轉(zhuǎn)化效率的感受態(tài)細(xì)胞(>108克隆/ugDNA)。 篩選重組克隆時(shí),需選擇抗菌素的濃度。
        不同廠家生產(chǎn)的miRNA定量檢測(cè)連接酶反應(yīng)條件稍有不同,但其產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)上均有zui適反應(yīng)條件,包括對(duì)不同末端性質(zhì)DNA分子連接的miRNA定量檢測(cè)連接酶的用量、作用溫度、時(shí)間等。同時(shí)提供有連接酶緩沖液(10×、5×、2×),其中多已含有要求濃度的ATP,應(yīng)避免高溫放置和反復(fù)凍融使其分解。目的DNA片段制備、回收、純化時(shí),應(yīng)避免外來(lái)DNA污染。連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化:miRNA定量檢測(cè)細(xì)菌細(xì)胞經(jīng)特殊試劑處理后在適當(dāng)?shù)臈l件下具有接收外源DNA的能力,因此可將上述連接產(chǎn)物通過(guò)熱刺激或電脈沖轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞,當(dāng)細(xì)菌大量增殖的同時(shí),導(dǎo)入的重組DNA也得到增殖。miRNA定量檢測(cè)態(tài)細(xì)胞所用離心管、培養(yǎng)瓶經(jīng)酸堿處理或使用新的,15 lbf/in2高壓滅菌20min。白色菌落中重組質(zhì)粒內(nèi)插入片段是否是目的片段需通過(guò)鑒定。
       
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